1. 為什么做靶向測序
高通量測序技術的廣泛應用，特別是二代測序的普及，使得科研人員能夠更容易更快速地獲取基因組信息。然而，一方面，獲取完整基因組仍然費用較高，特別是進行大量樣本檢測時。另一方面，如何發掘隱藏在海量測序數據背后的意義仍是短期內無法解決的問題。所以現在就說，我們進入了個人基因組時代還為時尚早。
在研究中，大多數的科研人員其實并不需要全部的基因組序列，也難以有效利用如此巨大的數據集。科研人員在很多情況下更需要高度的分析，例如檢測罕見疾病攜帶的變異，或是確保檢測的準確性和重復性。此外，在的醫學中，當人們只關注特定的基因或基因組區域時，受時間、費用和數據存儲等因素限制，對特定基因集（幾十到幾百個熱點基因）或是基因組的特定區域進行測序是更為合理的選擇。這種測序策略即為靶向測序。靶向測序能更經濟地實現大量樣本的檢測，實現遠高于基因組測序的測序深度和靈敏度，并且大幅提升突變發現能力。
2. 靶標捕獲可以更簡單嗎
目前主流的靶向序列捕獲方案主要有兩種，一種基于雜交靶向富集，另一種基于多重PCR靶向富集。現有的靶向文庫制備方法都不同程度的存在著均一性差、序列脫靶、操作流程繁復、操作時間長以及高昂的前期設備投入等問題。有沒有新的技術可以實現更簡單的靶向文庫制備，又能獲取更高特異性和均一性的文庫？是不是能一次反應就能同時完成靶向序列的捕獲和測序文庫的制備，而不需要額外的實驗操作？
答案是肯定的。zui近上市的VariantPro™靶向文庫制備系統，是一個基于多重PCR又不同于傳統多重PCR的靶向文庫制備技術，這個系統實現了一步操作即完成從靶向序列捕獲到測序文庫制備的全過程，而整個過程中只需人工操作5分鐘。這個新系統采用了兩項技術：OmegaPrimer™和RelayPCR™。這兩項技術又有什么過人之處？
3. *的形似Ω的引物
OmegaPrimer™是一個*不同于傳統的，形似Ω的*引物。這個引物帶有3個功能區，5p臂設計保證了引物穩定的結合模板，3p臂設計會雙重檢查結合特異性并啟動聚合酶延伸，兩臂之間的loop環起到間隔作用，同時又為后續文庫擴增提供通用引物（common primer）雜交的序列（圖1）。在OmegaPrimer™中3p臂被設計較短，因而在統計學上，將大幅降低多重PCR體系中形成可擴增引物二聚體幾率。這樣的設計大幅提升了引物的特異性，同時又能容忍模板出現個別堿基的突變。容忍模板出現個別堿基的突變有什么用處？這是一個非常有用的特性，考慮到在擁有30億個堿基對的人類基因組中有600萬個高等位基因頻率（> 1%）的SNPs，平均每500 bp就有1個SNP，這樣的引物寬容性就顯得非常必要了。
圖1 OmegaPrimer™含有3個功能區
4. 會自動接力的PCR
RelayPCR™（接力PCR）將一對通用引物和成百上千對（甚至更多）特異性引物（OmegaPrimer™）與基因組DNA混合在一個樣品管中。運行一次多重PCR即完成從特異性捕獲成百上千個靶向序列（區域）到高均一性制備測序文庫的全過程。這個設計帶來顯著簡化的工作流程。具體地，RelayPCR™可以通過控制成百上千對特異性引物（OmegaPrimer™）只在zui初靶標捕獲的兩個循環中發揮作用，之后會自動轉換到由一對通用引物（common primer）進行的文庫擴增反應。這種實驗策略消除了傳統多重PCR中多對特異性引物間存在的引物擴增效率差異的現象，從而確保了制備高均一性文庫（圖2）。在設計通用引物時，可以引入二代測序所需的引物（包括barcode），并且兼容主流的illumina和Ion Torrent測序平臺。當全部PCR反應結束后，測序文庫也一起制備完畢。
圖2 RelayPCR™實驗流程
由于反應體系中common primer的量遠大于specific primer（即omegaprimer™）的量，zui初靶標捕獲的兩個循環結束后，體系中出現了可與common primer雜交的擴增子時，PCR反應即自動切換到由一對common primer引導的文庫擴增階段。與common primer雜交結合的序列，來自omegaprimer™的loop環。
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5. VariantPro™表現如何
? *的文庫均一性
由于VariantPro™采用了Relay-PCR™技術，限制特異性引物（OmegaPrimer™）只在zui初2個循環——靶標捕獲時發揮作用，接著會自動切換到由通用引物主導的文庫擴增循環，直到反應結束，從而確保了生成*均一性的文庫（見圖3）。
擴增子覆蓋的均一性通常是由＞0.2×擴增子平均覆蓋度的序列所占百分比來測定。如下圖所示，VariantPro™系統制備的人類線粒體DNA文庫達到> 99.1%的均一性。
圖3 VariantPro™系統制備文庫具有*的文庫均一性
? *的重復性
樣品和文庫制備步驟中的誤差是破壞實驗重復性的一個潛在來源。這意味著實驗越復雜就越可能增加實驗誤差的幾率。VariantPro™具有極簡的工作流程，因而zui大限度地降低操作引起的誤差。測試實驗發現，運行不同的PCR循環數或采用不同的起始DNA量，都不會顯著影響測序結果的重復性（見圖4，5）。
| 15 cycles | 17 cycles | 19 cycles | 21 cycles | 23 cycles | 27 cycles |
15 cycles | 1.000 | 0.992 | 0.983 | 0.951 | 0.978 | 0.932 |
17 cycles | 0.992 | 1.000 | 0.995 | 0.969 | 0.984 | 0.919 |
19 cycles | 0.983 | 0.995 | 1.000 | 0.965 | 0.980 | 0.910 |
21 cycles | 0.951 | 0.969 | 0.965 | 1.000 | 0.973 | 0.890 |
23 cycles | 0.978 | 0.984 | 0.980 | 0.973 | 1.000 | 0.944 |
27 cycles | 0.932 | 0.919 | 0.910 | 0.890 | 0.944 | 1.000 |
圖4 不同PCR循環次數（15至27個循環）的相關系數分析表明，PCR循環次數不會影響文庫組成。
| 1.0 ng | 2.5 ng | 5.0 ng | 7.5 ng | 10.0 ng |
1.0 ng | 1.000 | 0.991 | 0.986 | 0.978 | 0.952 |
2.5 ng | 0.991 | 1.000 | 0.979 | 0.989 | 0.973 |
5.0 ng | 0.986 | 0.979 | 1.000 | 0.984 | 0.956 |
7.5 ng | 0.978 | 0.989 | 0.984 | 1.000 | 0.984 |
10.0 ng | 0.952 | 0.973 | 0.956 | 0.984 | 1.000 |
圖5 不同的模板gDNA（1.0至10.0 ng）的相關系數分析表明，反應所需模板量是靈活可變的。
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