科普：ELISA試劑盒技術基礎知識
一、酶免疫技術的分類
酶免疫技術是以酶標記的抗體或抗原為主要試劑的方法，是標記免疫技術的一種。免疫技術是利用抗原抗體反應進行的檢測方法，即應用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑，以檢測標本中的相應抗體或抗原。它的特點是具有高度的特異性和敏感性。ELISA試劑盒如將抗原或抗體用可以微量檢測的標記物（例如放射性核素、熒光素、酶等）進行標記，則在與標本中的相應抗體或抗原反應后，可以不必測定抗原抗體復合物本身，而測定復合物中的標記物，通過標記物的放大作用，進一步提高了免疫技術的敏感性。這種標記免疫技術一般分為兩類，一類用于組織切片或其他標本中抗原或抗體的定位；另一類用于液體標本中抗原或抗體的測定。前者屬于免疫組化技術范疇，后者則稱為免疫測定。
酶免疫測定根據(jù)抗原抗體反應后是否需要分離結合的與游離的酶標記物而分為均相和異相兩種類型，實際上所有的標記免疫測定均可分成這兩類。以標記抗體檢測標本中的抗原為例，按照簡單的形式是在試劑抗體過量的情況下進行，其反應式如下：
Ab*+ Ag——Ab*Ag+Ab*
Ab*Ag代表結合的標記物， Ab*為游離的標記物。如在抗原反應后，先把Ab*Ag與Ab* 分離；然后測定Ab*Ag或Ab*中的標記物的量，從而推算出標本中的抗原量，這種方法稱為異相法。如在抗原抗體反應后Ab*Ag中的標記物* 失去其特性，例如酶失去其活力，熒光物質不顯熒光，則不需要進行Ab*Ag 與Ab*的分離，可以直接測定游離的Ab* 量，從而推算出標本中的Ag含量，這種方法稱為均相法。
在異相法中，抗原和抗體如在液體中反應，分離游離和結合的標記物的方法有許多種。與放射免疫測定相類似的液相異相酶免疫技測定，在某些激素等定量測定中也有應用。但常用的酶免疫測定法為固相酶免疫測定。其特點是將抗原或抗體制成固相制劑，這樣在與標本中抗體或抗原反應后，只需經(jīng)過固相的洗滌，就可以達到抗原抗體復合物與其他物質的分離，大大簡化了操作步驟。這種被稱為EL1SA 的檢測技術成為目前臨床檢驗中應用較廣的免疫測定方法。
二、方法類型和操作步驟
ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：① 固相的抗原或抗體，② 酶標記的抗原或抗體，③ 酶作用的底物，根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。
（一）雙抗體夾心法：
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，ELISA試劑盒操作步驟如下：
（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與同相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
（3）加酶標抗體：使同相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
（4）加底物：酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
（二）雙位點一步法：
在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點一步法不但簡化了操作，縮短了反應時間，如果使用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應，類同于沉淀反應中抗原過剩的后滯現(xiàn)象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現(xiàn)假陰性結果。
（三）間接法測抗體 ：
間接法是檢測抗體時zui常用的方法，其原理為利用酶標記的抗-抗體檢測已與固相結合的受檢抗體。故稱為間接法。操作步驟如下：
（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由于不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如： 欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人lgG抗體。
（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。
（四）競爭法：
競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與同相抗體結合，因此結合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌。
（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與同相抗體的結合可達zui充分的量。洗滌。
（3）加底物顯色：參考管中由于結合的酶標抗原zui多，故顏色zui深，參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表于標本中抗原含量越多。
（五）捕獲法測lgM抗體
血清中針對某些抗原的特異性lgM常和特異性lgG伺時存在，后者會干擾lgM抗體的測定。因此測定lgM抗體多用捕獲法。先將所有血清lgM（包括異性lgM和非特異性lgM）固定在固相上，在除去lgG后再測定特異性lgM。
操作步驟如下：
（1）將抗人lgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人lgM。
（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應后血清中的lgM 抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性lgM 結合。
（4）加入針對特異性的酶標抗體，使之與結合在固相上的抗原反應結合。
（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性lgM抗體存在，為陽性反應。
（六）親和素和生物素的ELlSA親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4 個生物素分子親密結合。現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學方法制成的衍生物，生物素一羥基玻璃亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經(jīng)結合就極為穩(wěn)定。由于1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來，就可大大提高檢測的靈敏度。
親和素——生物素系統(tǒng)在ELISA中的應用有多種形式，ELISA試劑盒可用于間接包被，亦可用于終反應放大。可以在同相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原生物素結合，通過親和素——生物素反應而使生物素化的抗體或抗原固相化，這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規(guī)ISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素——酶結合物，以放大反應信號。
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